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Święta Polska
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krystian
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 Anatomie : chapitre 2
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1. CONDITIONS EXPERIMENTALES
1 1- Le sol
Le sol provient d’une parcelle expérimentale située à la Bouzule près de Nancy appartenant à
l’ENSAIA2. Le site de la Bouzule sert de plate-forme expérimentale au programme national
ADEME3 intitulé « Evaluation des risques écotoxicologiques liés à la valorisation agricole
des déchets et produits dérivés » (Shwartz et al, 2000). Il a également été reconnu comme
plate-forme expérimentale dans le cadre du programme GESSOL du Ministère de
l’Environnement. Le domaine expérimental de la Bouzule est situé à 12 km au nord Est de
Nancy sur le plateau Lorrain. Le sol de texture limono-argileuse est prélevé dans les horizons
situés entre 20 et 40 cm de profondeur. Ses principales caractéristiques sont décrites dans le
tableau II.1 (Shwartz et al, 2000).
Après prélèvement, le sol est tamisé à 2mm puis séché à l’air libre. Un tamisage à 2mm
permet le calibrage et l’élimination des débris végétaux.
2 ENSAIA : Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires.
3 ADEME : Agence De l’Environnement et de la Maîtrise de l’Energie.
23
Tableau II.1 Caractéristiques physico-chimiques de l’horizon AP du sol de la Bouzule
(Shwartz et al, 2000)
Granulométrie 5 fractions %
Argiles
Limons fins
Limons grossiers
Sables fins
Sables grossiers
32
41,4
16,8
3
7
Carbone (C) organique méthode Anne g/kg 16.5
Matière organique g/kg 28.4
Azote (N) organique total méthode Kjedhal g/kg 1.78
Rapport C/N 9.27
pH eau 7.4
Calcaire (CaCO3) total 2
Phosphore (P205) méthode Joret Hebert g/kg 0.135
CEC meq/kg 142
Calcium (Ca) échangeable meq/kg 146
Sodium (Na) échangeable meq/kg 0.38
Magnésium (Mg) échangeable meq/kg 10.6
Potassium (K) échangeable meq/kg 5.33
Cuivre (Cu) total HF -ICP-MS mg/kg 21.6
Fer (Fe) total HF-ICP-MS mg/kg 485
Zinc (Zn) total HF-ICP-MS mg/kg 130
Nickel (Ni) total HF-ICP-MS mg/kg 61
Plomb (Pb) total HF-ICP-MS mg/kg 48.5
Cadmium (Cd) total HF-ICP-MS mg/kg 0.84
24
1.2- La boue de station d’épuration (BSE)
Dans le cadre du programme ADEME « VADETOX » (valorisation agricole des déchets et
produits dérivés), différentes matrices déchettaires ont été étudiées. La boue utilisée est une
boue déshydratée, appelée B3.2, issue d’une boue liquide initiale B1 qui provient d’une
station d’épuration urbaine. Cette boue B3.2 a été artificiellement dopée en ETM via l’apport
de sels selon un procédé IRH4. Les polluants minéraux (Zn, Cu, Pb, Ni, Cd) sont apportés à la
boue B1 sous forme d’une solution aqueuse avant l’étape de déshydratation par filtre à bande.
Les concentrations finales ont été fixées pour tenir compte des teneurs de référence dans les
boues épandue en agriculture (Décret du Ministère de l’Environnement du 08/12/97). Les
teneurs en zinc, plomb et cadmium de la boue B3.2, sont supérieures aux teneurs limites
autorisées en deçà desquelles la boue est impropre à l’épandage (tableau II.2).
B1
Filière
déshydratation IRH
Boues urbaines épaissies
Dopage minéral
par hydrocureuse réinjection
dans circuit boue de STEP
Eau de ville
Polymère Zetag 83
6,5 kg/t de MS
Filtre à bande
B3.2
Figure II.1 Filière d’obtention de la boue B3.2
(d’après Bispo et Jourdain, 1998)
4 IRH : Institut de Recherche Hydrologique.
25
Tableau II.2 Teneurs en métaux de la boue B3.2 et teneur limites dans les boues fixées par
l’arrêté du 8 janvier 1998
exprimées en mg/kg de matière sèche (MS)
B3.2 Valeur limite
Arrêté du
8/01/98
Cuivre (mg/kg de MS) 939 1000
Plomb (mg/kg de MS) 909 800
Zinc (mg/kg de MS) 3643 3000
Nickel (mg/kg de MS) 246 200
Cadmium (mg/kg de MS) 26,9 10
Valeurs limites fixées par l’arrêté du 8 janvier 1998 qui fixent les prescriptions
techniques applicables aux épandages de boue sur les sols agricoles.
Tableau II.3 Composition chimique de la litière de Ray grass utilisée
% Carbone % Azote C/N Cu (mg/kg) Cd (mg/kg) Pb (mg/kg) Zn (mg/kg)
Litière 41,4 1,2 34,75 5,29 < détection 2,8 44,3
26
I.3 - La ressource trophique
La ressource trophique mise à disposition des vers est constituée de graminées prairiales
séchées prélevée sur une parcelle du Rheu située près de Rennes (35). La composition
chimique de cette « litière » est donnée dans le tableau II.4. Elle a été réalisée par le
laboratoire d’analyse des sols de Arras. La litière séchée est découpée en petits morceaux et
déposée en surface des microcosmes chaque semaine. Le dépôt de litière se fait à chaque fois
sur des zones différentes de façon à ce que toute la surface du sol se trouve en contact au
moins 1 fois avec la litière.
La quantité de litière apportée est inférieure à la consommation journalière estimée à 0.011g/g
de ver/jour (Lee, 1985 ; Edwards et Lofty, 1977, Jégou, 1998) afin d’obliger les lombriciens à
se nourrir de la MO du sol.
Lors de l’expérimentation 1 « Redistribution des ETM dans les biostructures », un jeun de 2
mois est imposé aux vers afin qu’ils se nourrissent de la MO du sol. Suite à ces deux mois de
privation, une quantité correspondant à 0.01g/ g de ver/jour de litière est déposée en surface
de chaque microcosme.
Lors de l’expérimentation 2 « Qualité des eaux de percolation », un pool minimum de
0.006mg/g/jour de litière est fournie aux lombriciens dès le début de l’expérimentation.
I.4 - Le matériel biologique
Deux espèces lombriciennes, appartenant à la catégorie écologique des anéciques (Bouché,
1984) sont utilisées : Lumbricus terrestris et Nicodrilus giardi. Ce choix repose sur différents
critères et travaux antérieurs comme :
- leur importance dans les processus de brassage et de redistribution de la MO sur
l’ensemble du profil de sol (Edwards et Lofty, 1977 ; Shipitalo et al, 1994 ; Tiunov et
Scheu, 1999).
- leur importance en terme de fréquence dans les agrosystèmes (Bouché, 1972 ;
Boström, 1988 ; Binet, 1993).
- leur plus ou moins grande sensibilité aux activités humaines (Cluzeau et al, 1987 ;
Edwards et Bohlen, 1996), leurs aptitudes biodémographiques (Cluzeau, 1992 ;
Bohlen et al, 1997) et leurs impacts pédogénétiques (Jégou et al, 1998 ; Subler et
Kirsch, 1998).
27
1.4.1 Lumbricus terrestris
Lumbricus terrestris (Linné, 1758 in Bouché, 1972) présente une pigmentation rouge pourpre.
Il mesure entre 130 et 250 mm de long et son poids est situé entre 5 et 15g (Bouché, 1972).
Cette espèce est considérée comme épianécique : elle a un comportement épigé quand la
litière est présente en grande quantité et un comportement anécique quand celle-ci est en
faible quantité.
Cette espèce est particulièrement étudiée car elle est présente dans la majorité des sols en zone
tempérée.
1.4.2 Nicodrilus giardi
Nicodrilus giardi (Savigny, 1826) est un anécique strict ou typique (Bouché, 1972). Il
présente une pigmentation brun-noir foncé, sa longueur est comprise entre 150 et 250 mm
pour un poids situé en 1.5 et 3.1 g. Cette espèce a une activité fouisseuse très importante
(Jégou, 1998).
Les vers sont récoltés sur une parcelle expérimentale du Lycée agricole de Le Rheu (35). Ils
sont capturés par la méthode formol (Raw, 1959) puis rincés plusieurs fois à l’eau. Les vers
issus d’un sol différent de celui de l’expérimentation sont placés en quarantaine dans du sol de
la Bouzule.
Des lots de 3 vers sont constitués avant introduction dans les microcosmes. Les lots sont
réalisés de telle façon que la biomasse inter-microcosme ne présente que des écarts inférieurs
à 1g.
I.5 Dispositif expérimental : les microcosmes
Les microcosmes sont des cylindres de PVC de 30 cm de haut et de 15 cm de diamètre
intérieur (figure II.1). Ils contiennent la colonne de terre devant accueillir les vers. Ils sont
recouverts d’un voile pour limiter la fuite des vers. En dessous, une toile grillagée de Nylon
retient la colonne de terre, tout en permettant une bonne évacuation de l’eau. Les eaux de
percolation sont collectées dans des bacs, placés au dessous de chaque microcosme.
28
15 cm
20 c
m
30 cm
Cylindre de PVC
Colonne de terre
Toile grillagée
(maille 0.5 mm)
Support
(récolte des percolats)
Voile de nylon
Saladier
Litière
Figure II.2 Schéma d’un microcosme (coupe longitudinale)
Tableau II 4 Conditions expérimentales des 2 expérimentations
Sol Boue Ver Litière Durée (jours)
Expérimentation 1 Bouzule B3.2 L.terrestris
N.giardi
Après 2 mois
d’incubation
240
Expérimentation 2 Bouzule B3.2 L.terrestris Dès le début 60
29
Sol
Sol sans boue = Modalité Témoin
Sol avec boue = Modalité Boue
Sans ver = T
Avec ver = T+ v
Sans ver = B
Avec ver = B+ v
Figure II.3 Diagramme récapitulatif des différentes modalités
I.6 Reconstitution de la colonne de sol
Le sol est réhumidifié avec de l’eau distillée (30 % du poids sec à 105°C), introduit et
compacté artificiellement dans les microcosmes. Le sol est compacté par couche de 4 cm
d’épaisseur, de façon à obtenir une densité d’environ 1,4. La colonne de sol constituée par
5kg de sol mesure 20 cm de hauteur.
Deux modalités sont construites : une modalité Témoin, sans boue et une modalité Boue.
Afin d’accentuer ses effets toxiques potentiels, la quantité de boue apportée correspond à
deux fois la dose terrain qui est de 15 t de MS (matière sèche) / ha / an : soit 40 g de MS pour
la surface du microcosme (0.017m²). La boue ne représente que 2% du poids total du mélange
sol + boue. Ce faible rapport qui correspond cependant à deux fois la dose terrain sera
susceptible de limiter certains résultats et observations. L’apport de boues, au champ est
raisonné en fonction de la quantité d’azote : il doit être en règle générale compris entre 1 et 2
kg de MS / ha. Dans le cadre de notre expérimentation, nous ne nous sommes pas intéressés à
l’azote mais aux ETM. C’est pourquoi l’apport d’azote, dans le cas de notre expérimentation
est de 7 à 15 fois supérieur à la pratique usuelle.
L’apport de boue est localisé uniquement dans les 10 premiers centimètres de la colonne où
elle est grossièrement mélangée au sol.
Le choix d’incorporer la boue uniquement dans les 10 premiers centimètres respecte la réalité
terrain. Pour les mêmes raisons, le mélange de la boue au sol est réalisé de façon grossière :
des boulettes de boues vont subsister dans l’horizon d’incorporation.
Pour chaque modalité, un traitement avec ver et un traitement sans ver est réalisé, chaque
traitement comprenant 3 répétitions.
30
I.6.1 Expérimentation 1 (Redistribution des ETM dans les biostructures)
L’expérimentation 1 est réalisée avec le sol de la Bouzule, la boue et les deux espèces
lombriciennes : Lumbricus terrestris et Nicodrilus giardi.
I.6.2 Expérimentation 2 (Qualité des eaux de percolation)
L’expérimentation 2 est réalisée avec le sol de la Bouzule, la boue et Lumbricus terrestris.
Les microcosmes sont placés dans une chambre climatisée et ventilée. La température
moyenne est de 12°C, et la photopériode 12 heures jour/12 heures nuit est appliquée au
système. Un arrosage régulier de 50ml d’eau distillée est réalisé deux fois par semaine. Ce
volume d’eau ajouté 2 fois par semaine a été choisi en fonction de la demande en percolats
des analyses (Carbone Organique Dissous, et Eléments traces métalliques).
L’incubation a duré 240 jours dans le cas de l’expérience 1 et 60 jours dans le cas de
l’expérience 2.
31
Sol + Boue
Sol
N1
N2
N1
N2
Litière
10 cm 10 cm
Modalité Témoin Modalité Boue
Figure II.4 Les modalités expérimentales
N3
N2
N1
Turricule (récolté 1 fois/semaine)
Parois de galerie N1= Pg1
Parois de galerie N2 = Pg2
Sol environnant N1= Se1
Sol environnant N2 = Se2
Echantillonnés
en fin d’incubation
après destruction de la
colonne N2
N1
Percolat (récolté 1 fois/semaine)
Figure II.5 Les compartiments étudiés
32
2. LES COMPARTIMENTS ETUDIES
2.1 Les turricules
Les turricules, déjections produites par les vers et laissées en surface, sont récoltés toutes les
semaines. Ils sont pesés, séchés à l’air libre puis stockés en chambre froide à 5°C.
2.2 Les parois de galeries et le sol environnant
En fin d’expérimentation, les colonnes de sol sont détruites afin d’échantillonner les parois de
galeries et le sol environnant. La colonne de sol est démoulée et divisée en deux niveaux :
• Le niveau N1 correspond aux 10 premiers centimètres de la colonne de sol. Pour les
modalités boue, ce niveau correspond à la zone d’apport de boue.
• Le niveau N2 correspond aux 10 derniers centimètres de la colonne de sol (10 - 20 cm).
L’analyse des teneurs en ETM dans les galeries et dans le sol environnant de ce niveau
permettra de mettre en évidence l’existence ou non d’une redistribution des métaux sur le
profil de la colonne de sol.
Les parois de galeries des lombriciens sont échantillonnées dans les différents niveaux.
L’échantillon est prélevé sur les 2 premiers mm de la paroi, cette zone étant plus riche en
carbone que la périphérie des galeries (2 -4 mm) (Bouché, 1975 ; Jégou, 1998; Tiunov et
Scheu, 1999).
Les parois sont échantillonnées au moyen d’une fine spatule, elles sont mises à sécher à l’air
libre puis tamisées à 2mm.
Le sol environnant correspond au sol situé à au moins 2 cm de toute trace d’activité
lombricienne. Il est mis à sécher à l’air libre, tamisé à 2mm. De même que pour les parois de
galeries, il est échantillonné dans les deux niveaux N1 et N2.
2.3 Les percolats
Les eaux de percolations sont récoltées chaque semaine le lendemain de l’apport d’eau
distillée. Les percolats sont filtrés à 0.45 µm et stockés en chambre froide (5°C) dans des
piluliers en polypropylène. Ces échantillons sont séparés en deux : ceux destinés aux analyses
de carbone organique dissous et ceux destinés aux analyses d’éléments traces métalliques. Les
échantillons destinés au dosage des éléments traces métalliques sont acidifiés par de l’acide
nitrique HNO3 concentré (1 mg d’acide pour 20 mg d’eau) de façon à obtenir un pH d’environ
33
1. Les échantillons destinés au dosage de carbone organique dissous ne subissent aucun
traitement particulier. Les eaux de percolations sont volumées à l’aide d’une burette graduée.
3. LES ANALYSES
3.1 Dosage du carbone organique dissous et des éléments traces métalliques dans les percolats
Le carbone organique dissous est dosé par un analyser de carbone (Shimadzu TOC 5050A).
Les éléments traces métalliques sont dosé par ICP-MS (Inductively coupled plasma - Mass
spectrometers) (Agilent 4500 Series System Diagram).
Pour le carbone et les éléments traces métalliques, des blancs sont réalisés avec l’eau distillée
servant à arroser les colonnes de sol.
Les éléments traces métalliques dosés sont le cuivre, le plomb, le cadmium et le zinc. Ces
éléments sont choisis en fonction de leurs propriétés (oligo-éléments ou non) et de leur
comportement dans le sol. Ainsi le cuivre et le zinc sont des oligo-éléments mais leur
comportement dans le sol diffère : Le cuivre est peu mobile et fortement retenu par la matière
organique, alors que le zinc est relativement mobile.
Le plomb et le cadmium ont été choisis en rapport aux problèmes de toxicité qu’ils peuvent
engendrer. De plus, le cadmium dont la phytotoxicité est reconnu, est l’un des éléments traces
les plus mobiles et est donc susceptible d’être transféré dans les eaux et poser des problèmes
de santé humaine.
3.2 Les extractions chimiques
Les extractions chimiques vont permettre de déterminer si après passage dans le tube digestif
du ver ou si après dépôt de mucus ou de déjection pour les parois de galerie, les métaux sont
redistribués sur d’autres constituants du sol et deviennent alors plus disponibles ou/et plus
mobiles.
Le protocole d’extraction chimique décris par Romkens (rapport CEA) et utilisé dans le cadre
de notre expérimentation est plus simple que celui décris par Tessier et al. (1979). Seules trois
fractions sont retenues au lieu des 5 citées dans le Chapitre I. Ce choix repose sur une
simplification des résultats obtenus et ainsi une meilleure lisibilité de l’impact des activités
lombriciennes sur la mobilité des ETM.
Les trois principales fractions retenues sont :
! la fraction échangeable, cette fraction détermine les métaux actuellement disponibles, elle
est comparable à la solution du sol.
34
! la fraction potentiellement échangeable, c’est à dire les métaux qui pourront être
transférés vers la fraction disponible sous certaines conditions (action bactérienne,
modification du pH, de la CEC, du potentiel d’oxydo-reduction…), donc les métaux fixés
sur les oxydes ou liés à la matière organique.
! la fraction résiduelle, c'est-à-dire les métaux inclus dans la matrice.
! la teneur totale.
3.2.1 La fraction échangeable
5 g de sol tamisé et séché sont placés dans un tube en polypropylène avec 10 ml de Ca(NO3)2
et mis en agitation pendant 48 h. La solution est centrifugée à 3000 tr/min pendant 20 mn, le
surnageant est filtré sur filtre plissé puis stocké en chambre froide avant dosage.
3.2.2 La fraction potentiellement échangeable
Une attaque douce à l’acide nitrique dilué permet d’extraire les éléments traces métalliques
présents dans cette fraction. 4g de sol tamisé et séché est placé dans un tube en polypropylène
avec 40 ml d’acide nitrique (HNO3) à 0.43 N et mis en agitation pendant 4 heures. Les tubes
sont ensuite centrifugés à 3000 tr/mn pendant 20 minutes. Le surnageant est filtré sur filtre
plissé puis stocké en chambre froide avant dosage.
3.2.3 La fraction résiduelle
Les ETM présents dans cette fraction sont déduits de ceux présents dans les fractions
échangeable et potentiellement échangeable des teneurs totales.
3.2.4 Les teneurs « totales »
Afin de doser les teneurs totales en éléments traces métalliques, le sol est minéralisé dans de
l’acide nitrique HNO3 suprapur en four à micro-onde (Fours MARS). A noter qu’avec une
attaque au HNO3, les éléments traces métalliques inclus dans la silice ne sont pas minéralisés.
Aussi, la teneur en éléments traces métalliques obtenue n’est pas exactement la teneur totale
en éléments traces métalliques du sol, mais s’en approche.
05 g de sol et 10 ml d’acide nitrique suprapur sont placés dans des réacteurs en téflon du Four.
Le protocole de minéralisation est adapté pour nos échantillons :
• Montée de la température et de la pression pendant 10 mn jusqu'à 200° C et 20 bar
• Maintien pendant 40 minutes à 200° C à une pression de 20 bar
• Refroidissement pendant 10mn (température 120 °C)
35
• Maintien pendant 40 minutes à 200 °C à une pression de 20 bar
• Fin de cycle refroidissement
Les éléments traces métalliques présents dans chaque fraction extraite sont dosés par
absorption atomique (Perkin elmer).
Ions solubles
Fraction résiduelle
libre
lié à la MO
et aux oxydes
Ca (NO3)2
à 0,01M
HNO3
à 0,43 M
inclus dans la matrice
Fraction
échangeable
Fraction
potentiellement
échangeable
Teneur Totale (extrait par HNO3 suprapur)
Figure II.5 – Schéma des fractions issues des extractions chimiques d’après Morel (1997)
3.3 Le fractionnement granulo-densimétrique
Le fractionnement granulo-densimétrique est réalisé sur les échantillons de la modalité
Bouz/B3.2. Les particules sont séparées selon leur densité et leur taille, sans destruction
préalable de la MO. Une séparation classique des particules est choisies : 200 -2000µm
(sables grossiers), 100-200 µm (sable moyen), 50 -100 µm sables fins, 20 -50 µm (limons
grossiers), 2-20 µm (limons fins), 0 -2 µm (argiles).
3.3.1 Principe du fractionnement granulo-densimétrique.
Le sol, après tamisage préalable à 2mm, est mis en agitation dans de l'eau (rapport 2/5)
pendant 16h. Il est ensuite tamisé sous eau. Les fractions récupérées sont les suivantes : 200-
2000µm, 100-200µm, 50-100µm et un jus (2 litres environ) contenant les particules < 50 µm
est récupéré.
Les MOP, les matières organiques particulaires ou figurées sont séparées de la matière
minérale par densimétrie pour les fractions de taille supérieure à 50µm. Les MOP plus légères
36
que la matière minérale, sont récupérées à partir de ces fractions primaires suivant la méthode
de la battée, c’est à dire par tri densimétrique dans l’eau. Les différentes fractions
granulométriques et densimétrique ainsi obtenues sont séchées à l’étuve à 40°C
Par la suite, la fraction 0-50µm est soumise à l'action des ultrasons afin de casser les agrégats
restant. Le "jus" est alors passé sur un tamis de 20 µm permettant de récupérer la fraction 20-
50µm.
La solution contenant les particules < 20µm est ensuite mélangée de façon à remettre les
particules en suspension. Puis elle est centrifugée à 800 tours/mn pendant 3mn (le temps de
centrifugation est déduit de la température de la solution). Le surnageant, qui contient les
particules < 2µm est siphonné, puis centrifugé 10 mn à 10000 tours/mn; il sert à rincer les
culots de 2-20µm.
La fraction 2-20 µm est obtenue à partir des culots issus de la centrifugation à 800 tours/mn
après rinçage à l'eau et lyophilisation. La fraction < 2µm est récoltée après lyophilisation des
culots de centrifugation à 10000 tours/mn.
Les différentes fractions issues du fractionnement granulo-densimétrique sont envoyés à
l’INRA de ARRAS ou des dosages de teneurs en carbone (NF ISO 10694), azote (NF ISO
13878) et éléments traces (mise en solution HF, dosage ICP-MS pour Cd et Pb et ICP-AES
pour Cu et Zn) sont réalisés sur les échantillons bruts avant fractionnement et sur les
différentes fractions granulo-densimétriques.
Sol
dispersion par
agitation mécanique
Tamisage sous eau
Récupération des fractions granulométriques
200 - 2000µm 100 - 200µm 50 - 100µm < 50 µm
50 - 100µm
MOP Min
Ultrasonification
< 20µm
Séparation, isolation
2- 20µm 0- 2 µm
Lyophilisation
Séparation des MOP de la matière minérale
par densimétrie (Flottaison)
20 - 50µm
MOP Min
100 - 200µm
MOP Min
200 - 2000µm
Figure II.6 Le fractionnement granulo-densimétrique
3.4 Les analyses statistiques
L’ensemble des traitements statistiques réalisé dans ce travail relève des comparaisons
multiples. Cette procédure consiste à comparer 2 à 2 l’ensemble ou une partie des résultats
(Sokal et Rohlf, 1981). Comme nos échantillons ne suivent pas une loi normale, nous avons
utilisé des tests non paramétriques (Siegel, 1959).
Selon que les échantillons sont liés ou non, les tests utilisés sont différents :
Dans le cas d’échantillons indépendants, le test de Man et Withney est utilisé pour comparer
les échantillons 2 à 2 et celui de Kruskall Wallis pour comparer l’ensemble des échantillons.
Dans le cas d’échantillons dépendants, les tests de Wilcoxon et de Friedman sont utilisés.
Wilcoxon étant l’alternative de Man et Withney pour des échantillons dépendant et Friedman
celui de Kruskall Wallis (Siegel, 1959).
Nos échantillons étant le plus souvent dépendants, les deux derniers tests sont les plus utilisés.
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 Posté le: Dim Fév 19, 2006 11:19 pm
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